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产品知识

一、普通PCR简述


1\发展简史
       20世纪60年代末70年代初,人们致力于研究基因的体外分离技术。Khorana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想。但是,当时的基因序列分析方法尚未成熟,对热具有较强稳定性的DNA聚合酶还未发现。1985年,美国科学家Kary Mullis发明了PCR技术,并在Science杂志上发表了关于PCR技术的第一篇学术论文。从此,PCR技术得到了生命科学界的普遍认同,Kary Mullis也因此而获得1993年的诺贝尔化学奖。1988年初,Keohanog通过对所使用的酶的改进,提高了扩增的真实性。尔后,Saiki等人又从生活在温泉中的水生嗜热杆菌内提取到一种耐热的DNA聚合酶,使得PCR技术的扩增效率大大提高。

 

2\技术原理
       DNA的半保留复制是生物进化和传代的重要途径。双链DNA在多种酶的作用下可以变性解链成单链,在DNA聚合酶与启动子的参与下,根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子挎贝。
       在聚合酶链式反应实验中发现,DNA在高温时也可以发生变性解链,当温度降低后又可以复性成为双链。因此,通过温度变化控制DNA的变性和复性,并设计引物做启动子,加入DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。( DNA高温变性低温复性)
       发现耐热DNA聚合同酶--Taq酶对于PCR的应用有里程碑的意义,该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活,不需要每个循环加酶,使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本,PCR技术得以大量应用,并逐步应用于临床。

 

3\普通PCR反应流程
 


 

4\反应原理

 


 

5\PCR循环

 


 

6\与荧光定量PCR技术相比较主要缺点


      1 常规PCR结合电泳分析方法的缺点
      2 只能对终产物进行分析,无法对起始模版准确定量
      3 必须在扩增反映结束后借助电泳方法分析,费时费事
      4 无法对扩增反应实时检测
      5 EB有毒

 

二、荧光PCR简述


       定义:在PCR反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号的变化,通过仪器软件实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化,通过Ct值和标准曲线实现对起始模板的定量分
析。
      荧光PCR检测分为两种方法:荧光探针法和荧光染料法。
      荧光探针法检测原理:

 

      荧光PCR如何实现实时监控的呢?
       PCR反应体系中加入荧光染料
       所有的定量PCR仪器都有三个共同的组成部分(检测器、激发光源、热循环模块)
       在扩增过程中,荧光信号随着PCR产物的增加而增强
       每个循环结束后,定量PCR仪器通过光学系统记录荧光信号的增加
       PCR软件计算出数据,用于实验结果的分析

      苏州旷远产品技术平台:ARMS检测方法;1个SNP位点设计双管反应,含目的基因检测及内参检测双通道。

 

 


      技术特点:
       准确可靠,临床双盲对照试验>1000例,结果与金标准测序法比对,结果一致性大于99%。
       高灵敏:可检测低至10ng的人基因组DNA。
       快速:整个检测流程只需3小时。
       简便:试剂盒提供预混好的试剂,使体系配置操作简便。
       防污染
       高特异性:双重特异性组成,保证检测结果的特异性和准确性引物与DNA互补链结合必需完全配对,才能延伸。探针特异性与所检测基因的PCR产物配对,在延伸中产生荧光。


      临床基因检测技术比较:

 

方法 原理 适用 优点 弱点 操作 准确性 市场应用
DNA芯片 PCR-芯片杂交 多位点 多基因,多为点同时 少数位点 步骤多,易污染 较高 临床使用
PCR-RFLP PCR-酶切-电泳 SNP位点 多位点 步骤多,易污染 较高 逐步淘汰
Sanger测序 PCR-测序 SNP位点,缺失突变   时间长 步骤多 金标准 无注册证
PCR-荧光染料法 荧光PCR 单个基因 快速,简便 假阳性 简单一步 核酸检测
PCR-荧光探针法 Taqman SNP,多态性 快速,简便 少数位点 简单一步 普及
液相芯片法 PCR-液相杂交 SNP, 多基因,多位点   易污染 步骤多 较高 非主流